Médecine régénérative des cellules productrices d’insuline - Comment remplacer les cellules manquantes chez les diabétiques ?

Quels arguments pour justifier le remplacement des cellules bêta ? Le diabète de type 1 – il affecte moins de 10 % de la population totale des diabétiques et se manifeste plutôt avant l’adolescence – est dû à une destruction spécifique et totale des cellules productrices d’insuline (les cellules bêta) des îlots de Langerhans du pancréas, par le propre système immunitaire du patient (réaction autoimmune). La survie du patient repose sur l’administration journalière d’insuline. Toute stratégie visant à remplacer les cellules bêta représente donc logiquement le moyen (potentiellement idéal) de guérir le diabète de type 1. On sait bien maintenant que la transplantation d’îlots est un moyen efficace pour affranchir les diabétiques de type 1 de l’insulinothérapie pendant quelques années (au maximum 2 ans ?), mais la greffe d’îlots s’accompagne obligatoirement d’un traitement immunosuppresseur aux effets quelquefois toxiques. Le potentiel de ce type de traitement reste de toute façon très limité puisque le nombre de donneurs d’îlots humains est très largement insuffisant pour couvrir la demande. Le diabète de type 2 – il est souvent mais pas toujours associé à l’obésité et devient de plus en plus fréquent, même chez les jeunes – résulte de la combinaison d’un défaut d’action tissulaire de l’insuline (c’est l’insulinorésistance) et d’un déficit (plus ou moins marqué) de sécrétion d’insuline. On le traite d’abord par des agents hypoglycémiants (actifs par voie orale), et éventuellement par l’insulinothérapie dans les stades ultimes. Contrairement au dogme en vigueur il y a encore une dizaine d’années, les diabétologues reconnaissent maintenant que le nombre total (on parle aussi de masse) des cellules bêta (et d’îlots) est déficitaire au cours du diabète de type 2 : on admet qu’il est réduit de moitié. Le remplacement des cellules bêta manquantes constitue donc une réponse thérapeutique potentielle pour rétablir la production endogène d’insuline chez les diabétiques de type 2. La population des cellules bêta : comprendre sa genèse, ses fluctuations, son extinction Les cellules bêta comme les cellules exocrines (qui produisent des enzymes nécessaires à la digestion) du pancréas sont issues de cellules épithéliales qui composent la paroi des canaux pancréatiques. Ces canaux contiennent des cellules précurseurs (cellules pluripotentes progénitrices) capables de se différencier en cellules exocrines ou endocrines (dont bêta). Ces cellules bêta s’assemblent ensuite pour former des amas endocrines, les îlots de Langerhans. On sait maintenant que le nombre total d’îlots (et donc de cellules bêta) résulte d’un équilibre dynamique entre trois mécanismes dont on commence à bien comprendre le fonctionnement : - la réplication de cellules bêta différenciées préexistantes ; - la différenciation de cellules progénitrices en cellules bêta (appelée néogenèse) ; - et la mort cellulaire programmée (ou apoptose). Ces processus sont fondamentaux pour la mise en place du développement du pancréas endocrine chez le fœtus et le nouveau-né, mais ils sont aussi nécessaires chez l’adulte pour le maintien de la population bêta et son adaptation aux besoins insuliniques tout au long de la vie adulte. Jusqu’à un passé récent, la population bêta était considérée comme un élément peu susceptible de variations chez l’adulte, en raison de la faible capacité de prolifération de ces cellules comparativement à celle du nouveau-né. Des données essentiellement expérimentales obtenues chez les rongeurs de laboratoire ont bouleversé ce point de vue, et à présent tout le monde s’accorde sur l’existence chez l’adulte d’une plasticité non négligeable de la population bêta.     Évidemment, cette capacité d’adaptation a des limites finies et lorsque les bornes extrêmes sont atteintes, la rupture de l’équilibre qui en résulte se traduit par un déficit plus ou moins important du nombre des cellules bêta : c’est typiquement ce qui se produit dans les diabètes (voir paragraphe précédent). Il est cependant important de ne pas oublier que l’essentiel de ces concepts a été bâti à partir de modèles animaux chez lesquels l’exploration invasive est possible. Précisons que l’exploration pancréatique invasive consiste à prélever, après sacrifice de l’animal de laboratoire, un échantillon du tissu pancréatique et à quantifier le nombre des cellules bêta par des méthodes immunohistochimiques. Elle est possible chez l’homme uniquement à partir du tissu prélevé post-mortem. L’extrapolation à l’humain des données obtenues avec les modèles animaux, même si elle est hautement probable, reste donc très délicate. Il n’existe en effet pas encore de technique pour mesurer de façon non invasive et répétitive le nombre de cellules bêta ou leur fonction individuelle chez l’homme. L’espoir est de mise cependant, car des méthodes inspirées de celles utilisées pour l’exploration non invasive du cerveau (tomographie avec émission de positron ou PET ; imagerie par résonance magnétique ou IRM) sont en phase d’expérimentation chez l’animal. Les obstacles à vaincre pour l’application au pancréas humain sont immenses, mais c’est là que se situe le prochain progrès qui fera faire un pas de géant à la diabétologie. Quelles stratégies biologiques utiliser pour remplacer les cellules bêta manquantes ? Ou comment faire du neuf avec du vieux… Elles relèvent de ce que l’on appelle la médecine régénérative. Les techniques de thérapie régénérative actuellement en cours d’évaluation expérimentale (préclinique) sont de trois sortes : la thérapie cellulaire basée sur la régénération in vitro, la thérapie cellulaire basée sur la régénération ex vivo, et la thérapie cellulaire basée sur la régénération in vivo (figure 1).   Figure 1. Les principales stratégies actuellement en cours d’investigation pour restaurer un nombre suffisant de cellules bêta chez les diabétiques. La thérapie basée sur la régénération in vitro de cellules bêta Elle utilise des cellules qui ne sont jamais celles du patient et qui sont en général des cellules embryonnaires totipotentes comme les cellules souches embryonnaires (appelées cellules ES). Ces cellules sont issues de la couche cellulaire interne du blastocyste, qui est capable de se différencier en n’importe lequel des types cellulaires de l’organisme. Elles sont cultivables et les biologistes recherchent les conditions d’une différenciation en cellules bêta in vitro. Une fois différenciées, elles sont implantées chez le diabétique (pour l’instant, chez l’animal diabétique uniquement). La faisabilité de cette option technique (obtenir le passage de la cellule souche à la cellule différenciée) est bien démontrée dans le cas de la production de cellules cutanées utilisées dans les greffes de peau artificielle. Elle est peu efficace pour obtenir des cellules bêta bien différenciées. Dans tous les cas, l’implantation des cellules bêta néoformées in vitro impose l’utilisation des immunosuppresseurs à vie. Or, comme déjà évoqué à propos des greffes tissulaires (îlots ou segment de pancréas), les médicaments immunosuppresseurs ont certains effets secondaires toxiques (néphro-toxicité, hypertension, susceptibilité aux tumeurs et aux infections opportunistes). Cela limite donc fortement l’application clinique à grande échelle de ce type de stratégie basée sur la fabrication (ingénierie in vitro) de cellules bêta à partir de cellules souches qui ne sont pas celles du patient. La thérapie basée sur la régénération ex vivo de cellules bêta Il s’agit ici d’utiliser des cellules qui proviennent du patient lui-même. Ces cellules, après manipulation in vitro destinée à induire leur différenciation en cellules bêta fonctionnelles, seront réimplantées ultérieurement chez le patient. Ces cellules n’étant pas rejetées par le système immunitaire, cette stratégie permet donc de s’affranchir de tout traitement immuno-suppresseur et de son cortège d’inconvénients. La stratégie adoptée est de fabriquer des cellules ES chez un patient donné, en transférant les noyaux de cellules somatiques (non germinales) du patient dans des ovocytes énucléés provenant d’une autre personne. Ce type de protocole reste cependant de réalisation difficile et soumis à des règles légales contraignantes et variables selon les pays. Cela limite donc fortement les perspectives d’application clinique de cette stratégie basée sur les cellules ES. On peut cependant contourner cet obstacle en utilisant les cellules souches mésenchymateuses du patient comme succédané de ses cellules ES. Ces cellules souches mésenchymateuses persistent dans la moelle osseuse tout au long de la vie adulte. Sous certaines conditions expérimentales (injection dans un blastocyste), ces cellules peuvent se différencier in vitro et former différents tissus tels que la rétine, le poumon, le myocarde, le muscle squelettique, le foie, le rein, l’intestin, la rate, le sang ou la peau. Malheureusement, elles se sont révélées jusque-là incapables de se différencier in vitro en cellules bêta. De loin plus prometteuses sont les récentes découvertes montrant qu’il est possible de reprogrammer des cellules somatiques adultes matures (par exemple des fibroblastes) en cellules souches pluripotentes dites « iPS » (induced Pluripotent Stem cell). Une première preuve que le concept est efficace pour l’obtention de nouvelles cellules bêta a ainsi été rapportée : la transformation de cellules acineuses de pancréas de souris adultes en cellules produisant de l’insuline (donc, bêta) a pu être obtenue en injectant dans le pancréas un mélange de virus codant pour trois facteurs clés de différenciation (Pdx1, Ngn3 et MafA) (figure 2).   Figure 2. Comment fabriquer de nouvelles cellules bêta ?  1. In vivo, on peut espérer induire la prolifération des cellules bêta existantes et/ou la reprogrammation vers le phénotype bêta d’autres types cellulaires pancréatiques (cellules exocrines). 2. In vitro, on peut espérer obtenir de nouvelles cellules bêta à partir de la manipulation des cellules souches, qu’elles soient de type ES ou iPS, puis dans un deuxième temps transplanter chez le diabétique les cellules ayant un phénotype bêta acceptable. La thérapie basée sur la régénération in vivo de cellules bêta Il existe de multiples situations pathologiques illustrant la possibilité pour un patient de régénérer in situ (in vivo donc) certaines cellules au sein d’un tissu initialement lésé. Ainsi, il a été montré récemment qu’au cours de l’infarctus du myocarde, des cellules souches présentes dans la moelle osseuse sont mobilisées et migrent via la circulation générale pour aller se différencier en cellules myocardiques au niveau de l’infarct. Cette régénération de cellules du muscle cardiaque améliore fortement le pronostic clinique du patient et elle peut être amplifiée par l’administration in vivo de certains facteurs de croissance. Une telle stratégie basée sur la régénération in vivo, cette foisci de cellules bêta, pourrait avoir une application universelle à tous les types de diabète : en effet, elle est éthiquement acceptable ; elle semble avoir peu d’effets secondaires ; elle est peu coûteuse. Il y a deux options possibles pour obtenir la régénération in vivo de cellules bêta : - l’induction de la différenciation in situ de nouvelles cellules bêta (appelée aussi néogenèse) ; - l’induction de la croissance (augmentation du nombre) des cellules bêta encore présentes (figure 2). Comment induire la différenciation in vivo de nouvelles cellules bêta ? C’est là que les connaissances fondamentales en biologie du développement se révèlent précieuses. On sait que plusieurs tissus intestinaux, tels que le foie, le duodénum, la vésicule biliaire et le pancréas en particulier, dérivent tous d’un organe embryonnaire commun appelé intestin primitif. À ce titre, ils contiennent tous, même à l’âge adulte, des cellules dites « progénitrices » (ou cellules somatiques pluripotentes, dites « SP »), qui ont gardé le potentiel de se différencier (ce ne sont pas des cellules ES) en cellules bêta dans certaines conditions. Il semble moins compliqué d’obtenir des cellules bêta à partir de ces cellules SP qu’à partir des cellules ES (figure 2). Par exemple, il a été montré récemment, chez la souris, qu’on peut obtenir des cellules sécrétrices d’insuline (donc, bêta) au sein même du tissu hépatique, en réorientant la différenciation des cellules hépatiques grâce à un signal peptidique dont la production par le foie est induite par une manipulation génétique (le facteur de transcription appelé Pdx1). Cette néogenèse de cellules bêta au sein du foie est suffisamment efficace pour corriger l’hyperglycémie des souris rendues diabétiques au préalable. • Pour ce qui concerne les possibilités d’activer la néogenèse bêta au sein du pancréas luimême, l’injection rétrograde d’un vecteur génique permettant l’expression de l’activateur Pdx1 dans les canaux exocrines pancréatiques déclenche la différenciation de cellules de la paroi des canaux en nouvelles cellules bêta : cela a été validé chez la souris. La même approche par injection rétrograde dans les canaux pancréatiques est tout à fait envisageable chez l’homme diabétique (elle est peu invasive, car réalisable sous endoscopie). • Compte tenu des résultats déjà disponibles avec les études précliniques chez les rongeurs diabétiques, il est même tout à fait envisageable d’utiliser non plus des vecteurs géniques (ce qui simplifie encore le schéma thérapeutique), mais certaines molécules à effet pharmacologique et/ou certains facteurs de croissance naturels capables d’activer la néogenèse de cellules bêta à partir des cellules précurseurs canalaires mentionnées ci-dessus. Une expérimentation menée au sein de notre équipe de recherche a par exemple montré que le GLP1, qui est une hormone naturelle d’origine intestinale, était ainsi capable d’activer la régénération de cellules bêta par néogenèse chez le rongeur diabétique (diabète de type 2). Or, des médicaments antidiabétiques qui visent à augmenter le taux circulant de GLP1 (les gliptines) et des analogues du GLP1 de longue durée d’action ont été mis récemment sur le marché. Outre leur effet aigu activateur de la sécrétion de l’insuline, il est tout à fait envisageable que ces molécules soient aussi efficaces au long cours en favorisant la régénération bêta. Si tel était le cas (la preuve a été faite chez l’animal diabétique, mais la démonstration reste à faire chez l’homme), on entrerait dans une véritable nouvelle ère pour le traitement des diabètes : celle de la thérapie réparatrice du pancréas endocrine, simple à mettre en oeuvre puisque obtenue par l’administration (voie orale) d’activateurs pharmacologiques de la régénération bêta. • Très récemment, notre équipe de recherche s’est intéressée à l’implication de la voie de signalisation Wnt/bêta-caténine dans la régulation de la masse bêta- cellulaire. Pour démontrer l’importance potentielle de cette voie, nous avons développé une stratégie qui permet de bloquer de façon très spécifique l’expression de GSK3bêta, une kinase majeure pour le fonctionnement de la voie. Cette stratégie, qui fonctionne in vivo, repose sur l’utilisation d’un oligonucléotide antisens (ARN antisens) qui bloque la traduction de l’ARNm de GSK3bêta (et donc la synthèse de la protéine GSK3bêta). L’administration de l’ARN antisens (sous forme morpholino, ou MoAS) à l’animal diminue temporairement l’expression de GSK3bêta dans le pancréas et provoque une augmentation des effets biologiques (prolifération cellulaire) des effecteurs distaux (bêta-caténine) de la voie, du fait de la levée d’inhibition exercée par GSK3bêta sur ces effecteurs (figures 3 et 4).   Figure 3. L’utilisation d’un ARN antisens de type morpholino-oligonucléotide (MoAS) permet de bloquer de façon spécifique la traduction de l’ARN messager ciblé, dans la population des cellules exposées au MoAS. Le blocage est temporaire (différence avec un blocage par invalidation génique qui, lui, est définitif). Ici, la cible est la protéine GSK3bêta, kinase qui joue un rôle clé dans l’activité de la voie de signalisation Wnt/bêta-caténine. Figure 4. L’utilisation d’un MoAS anti-GSK3bêta permet de bloquer de façon temporaire l’expression de la protéine GSK3bêta qui exerce normalement un rôle frein. La levée de l’inhibition provoque l’activation des effecteurs distaux de la voie (en particulier, bêta-caténine). Cela se traduit in fine par l’augmentation de la réplication des cellules bêta déjà présentes et la différenciation de nouvelles cellules bêta à partir de cellules précurseurs pancréatiques. La preuve expérimentale validant le concept est apportée dans l’expérience dont les résultats sont décrits ici. Le MoAS anti-GSK3bêta est administré in vivo directement dans le tissu pancréatique résiduel chez le rat adulte après pancréatectomie (Px) à 90 %. Le groupe contrôle reçoit un MoAS non spécifique. L’inhibition temporaire de GSK3bêta stimule la régénération de la masse des cellules bêta une semaine après la Px. L’augmentation de la masse bêtacellulaire est maintenue 4 semaines après l’opération.    Nous avons ainsi d’abord montré l’implication de la voie Wnt/bêta-caténine dans la croissance normale des cellules bêta chez le jeune rat : les effecteurs distaux de la voie Wnt (TCF7L2 et bêta-caténine) régulent la croissance normale des cellules bêta pendant la période néonatale. Nous avons ensuite évalué la possibilité d’activer la régénération des cellules bêta (néogenèse bêta + prolifération bêta) dans divers modèles animaux déficitaires en cellules bêta, en activant spécifiquement cette voie. Nos résultats montrent que tel est bien le cas, dans des modèles de diabète néonatal induit (rat n0-STZ) ou spontané (rat GK), ou encore chez le rat adulte après pancréatectomie à 90 % (figure 5).   Figure 5. La voie de signalisation Wnt/bêta-caténine est impliquée dans la régulation de la masse bêtacellulaire.  Nos travaux montrent : (1) l’implication de cette voie dans la croissance normale des cellules bêta chez le jeune rat normal ; (2) son rôle dans la régénération bêtacellulaire compensatrice dans des modèles de diabète chez le jeune rat, induit (rat n-STZ) ou spontané (rat GK) ; (3) son rôle dans la régénération des cellules bêtapancréatiques chez l’adulte après pancréatectomie à 90 %. Il est à retenir que l’activation temporaire in vivo de cette voie de signalisation par inhibition de GSK3bêta stimule la régénération des cellules bêta dans les modèles de diabète avec déficit bêtacellulaire.   Ces données importantes impliquent pour la première fois la voie Wnt canonique dans la régulation des phénomènes de croissance compensatoire des cellules bêta et, de ce fait, offrent une nouvelle cible d’intervention pour la médecine régénérative. L’approche originale utilisée pour la démonstration valide aussi l’utilité in vivo des oligonucléotides antisens pour moduler de façon transitoire la croissance cellulaire compensatrice (concept d’ARN « médicament »). Comment induire la multiplication in vivo de cellules bêta déjà présentes ? Les diabétologues ont longtemps vécu sur l’idée que les cellules bêta, une fois totalement différenciées (donc chez l’adulte), étaient à peu près incapables de se multiplier. Là encore, la recherche cognitive fondamentale sur les modèles animaux nous a appris que les cellules bêta se multiplient activement (on reparle de réplication) chez le fœtus et peu après la naissance, et qu’il existe toute une batterie d’hormones et de facteurs de croissance naturels qui sont capables d’induire la multiplication des cellules bêta même déjà différenciées. Cela ouvre donc la porte à l’utilisation pharmacologique de ces molécules pour favoriser la reconstitution de la population des cellules bêta chez les diabétiques, en favorisant un deuxième mécanisme de régénération, indépendant de la néogenèse, mais complémentaire. Là aussi, les études précliniques chez l’animal sont très encourageantes puisqu’elles ont prouvé en particulier que certaines des molécules efficaces sur la néogenèse le sont aussi sur la réplication ; au premier rang de celles-ci, on retrouve à nouveau le GLP1 et ses analogues, et l’inactivation de GSK3bêta par oligonucléotide antisens.  Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflit d’intérêts en relation avec cet article.